Нормальными показателями спермограммы считали концентрацию сперматозоидов 20 млн и более в 1 мл, долю прогрессивно подвижной фракции более 40% и морфологически нормальных форм - более 40%.
Методом проточной цитофотометрии проанализировано 176 образцов спермы пациентов, проходящих лечение бесплодия в программе ЭКО в Центре репродукции ЭКО (Институт акушерства и гинекологии РАМН и Чикагский институт репродуктивной генетики). Для получения зрелых применяли стимуляцию с помощью гонадотропных гормонов [12]. Для культивирования использовали среду Ham F-10 с альбумином человека и синтетическим заменителем сыворотки фирмы "Medi-Cult" (Дания). Выделение прогрессивно подвижной фракции сперматозоидов проводили в . Для оплодотворения в среду к ооцитам вводили 100 000 сперматозоидов. Оплодотворение определяли через 18 ч после введения сперматозоидов по наличию двух . Частоту оплодотворения рассчитывали как отношение числа к числу ооцитов. Вычисляли долю с нормальной морфологией - без фрагментации . Число бластомеров в эмбрионах определяли через 24 и 48 ч после образования пронуклеусов.
Данные о влиянии степени компактизации хроматина сперматозоидов на процессы оплодотворения и эмбрионального развития в культуре достаточно противоречивы. Большинство авторов считают, что тесты, оценивающие состояние хроматина мужских половых клеток, позволяют прогнозировать способность сперматозоидов к оплодотворению и могут иметь диагностическое значение [4]. Некоторые авторы не выявили взаимосвязи этих параметров [10]. В большинстве работ дается субъективная оценка состояния хроматина по степени окрашиваемости ядер анилиновым синим, акридиновым оранжевым или же по тесту на деконденсацию хроматина, что затрудняет интерпретацию полученных результатов. Использование флюорохрома хромомицина показало, что при наличии в эякуляте сперматозоидов с дефектами в организации хроматина повышается частота нарушения деконденсации их ядер в цитоплазме ооцитов после ICSI [5], а также уменьшается частота оплодотворения после инъекции сперматозоидов с помощью микроманипулятора под блестящую оболочку - SUZI [7].
Нами разработан простой, легко интерпретируемый, количественный метод оценки интактности организации ядерного материала спермиев, пригодный для клинического использования. Основой метода явилось то, что ключевой момент плотной упаковки хроматина спермиев - поперечное сшивание протаминов дисульфидными связями - является завершающим этапом дифференцировки спермиев и важно для их функции. Для оценки степени компактизации хроматина ядер спермиев использовался эффект экранирования белками хроматина связывания с ДНК флюоресцентного красителя этидия бромида. Попытка экстрагировать из хроматина основные белки путем обработки полианионами (гепарином) без размыкания дисульфидных связей приводит к удалению той части белков, которая не была сшита поперечными ковалентными дисульфидными мостиками. В результате доступность ДНК для связывания этидия бромида возрастает. Таким образом, связывание этидия бромида с ДНК отдельных клеток, измеряемое методом проточной цитофлюорометрии, может служить мерой эффективности компактизации хроматина спермия в процессе дифференцировки.
В литературе существуют указания на корреляцию между нарушениями в организации ядер спермиев и их способностью к оплодотворению [4-7]. В настоящее время на практике используется методика оценки организации хроматина ядер спермиев, основанная на полихромной окраске ядер акридиновым оранжевым [8, 9]. Однако этот метод можно расценивать как эмпирический, поскольку механизм действия красителя не ясен, а методика окрашивания мало стандартизирована.
Стандартные клинические методы диагностики нарушения связаны с анализом концентрации , их подвижности и морфологии [1]. В последние годы появился новый способ оценки строгой морфологии сперматозоидов, позволяющий предсказать частоту оплодотворения в культуре, а также были предложены методы определения способности cперматозоидов к связыванию c блестящей оболочкой [2, 3]. Эти методы характеризуют причины, препятствующие слиянию половых клеток. Если бы все причины мужского бесплодия сводились только к подобным дефектам, то они легко преодолевались бы оплодотворением в культуре ( - ЭКО). Применение (интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида) должно было бы решить все проблемы. Несмотря на то, что ЭКО действительно облегчает слияние клеток, получить беременность иногда не удается даже после многократных попыток. Возможно, одной из причин могут являться нарушения в самой организации переносимого генетического материала, что может препятствовать последующим за слиянием половых клеток процессам развития.
Изучено влияние степени компактизации хроматина ядер сперматозоидов на процессы оплодотворения и развития эмбрионов в программе ЭКО. Степень компактизации хроматина была проанализирована с помощью предложенного нами количественного проточно-цитофотометрического способа.
О.А. Воробьева, М.В. Филатов, О.А. Леонтьева, Е.В. СеменоваИнститут акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта, Центр ЭКО, Институт ядерной физики им. А.К. Константинова РАН, С.-Петербург
Комментариев нет:
Отправить комментарий